5000字让你了解外泌体蛋白质组 | 蛋白专题
细胞外囊泡（EVs）是指细胞主动分泌的具有膜结构的微小囊泡的统称，几乎所有细胞都会分泌EVs，然而很长时间EVs一直被人们认为只是细胞向外运输物质及细胞移除碎片和清除大分子物质的一种途径，很长时间并没有引起人们的注意。直至1983年Harding等人发现网织红细胞在成熟过程中分泌的小于50nm的小囊泡可以传递蛋白至细胞外空间，后来Rose Johnstone将这类EVs命名为“外泌体”（exosome）。起初人们并没有意识到外泌体的重要作用，直到1996年Raposo等发现B淋巴细胞分泌的Evs可呈递抗原激活T淋巴细胞，参与免疫细胞的调控功能，人们才逐渐了解EVs的重要性，近年研究也发现EVs可以作为遗传信息的传递者，携带和传递信号分子运输到相邻或者远处的细胞，从而调节细胞的生理和病理状态，参与许多疾病的发生和发展的过程，Evs在疾病的诊断和预后等方面也具有广阔的应用前景。
虽然EVs是用来特指细胞分泌的具有膜结构的一类囊泡，但是往往不同大小、密度不同、细胞来源不同形式多种多样，很难对所有EVs进行描述。国际细胞外囊泡学会建议利用EVs的理化性质如大小、密度及生化组成（表达CD63/CD81的Evs或者表达Annexin A5的EVs）等特征来描述EVs。
最后根据其大小、生物特性和合成过程不同，EVs主要分为外泌体（exosome）、微囊泡（Microvesicles MV）和凋亡小体（Apoptotic bodies）三大类。
外泌体的形成、外泌体包裹内容物的分拣和外泌体的释放是非常精细的调控过程，需要很多蛋白参与其中。首先，外泌体的形成涉及内吞体分选转运复合体（ESCRT）、四次跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）、凋亡链接基因2相互作用X(Alix)和肿瘤易感基因101蛋白质（TSG101）等蛋白的参与，其次，外泌体的细胞内运输涉及很多分子开关RAB GTPase蛋白和细胞骨架蛋白如肌动蛋白和微管蛋白的参与，最后，外泌体的分泌需要SNARE蛋白复合物和突触蛋白家族的参与。
外泌体的蛋白质组成可以体现它们细胞内来源特征，在不同类型细胞和体液中，外泌体都含有相同的标记分子，如Alix、TSG101、SNARE、RAB GTPase和四次跨膜蛋白CD9、CD63、CD81等，除了特定的蛋白组成，外泌体也有特殊的脂质组成。外泌体膜富含胆固醇、神经酰胺和鞘磷脂，这些脂质都参与外泌体的形成和分泌过程。
Evs形成和分泌的细胞内通路
Evs细胞释放既可以通过质膜向外出芽(微囊途径)，也可以通过内体膜向内出芽(外泌体途径)。外泌体首先是起源于内吞的小泡，在质膜内陷形成早期核内体之后，由于核内多泡体(MVB)进一步向内出芽，外泌体形成腔内小泡。最后，外泌体通过MVB与质膜融合而分泌。
外泌体作为机体天然信息传递的载体在细胞间通信中发挥着重要作用，由于蛋白质是外泌体的重要组成成分，分析外泌体的蛋白质组成有助于推动外泌体功能的研究，基于质谱的蛋白质组学的技术为外泌体的蛋白质组成提供了技术保障。通常全面研究外泌体的蛋白质有两个目的，①.研究外泌体及蛋白质在生命活动如疾病发生和进展中的作用。②.发现与疾病相关的蛋白质，作为疾病早期诊断和预后评估的生物标志物。
研究外泌体的蛋白质组，基本包含三个步骤，①.外泌体的分离纯化和表征。②利用质谱的技术鉴定外泌体蛋白的组成。③.外泌体蛋白质组数据分析。外泌体蛋白质组学的研究离不开对外泌体分离纯化、外泌体鉴定、采用的蛋白质组学策略，我们对以上三点进行总结。
外泌体分离纯化的方法：外泌体的分离和纯化可以采用超高速离心、密度梯度离心、免疫亲和方法、尺寸排阻色谱法、聚合沉淀法和自由电泳等技术。通过外泌体的富集和分离还需要对分离的外泌体进行鉴定。
外泌体常见的鉴定方法：利用纳米颗粒跟踪分析技术定量分析外泌体的浓度和粒径、利用电镜直接观察其形态大小、或者利用外泌体常用的标志蛋白质（CD63、CD9、TSG101）等。
外泌体常见的蛋白质组学方法：外泌体的蛋白质组学鉴定基本和常规蛋白质组鉴定方法一致，都是基于（bottom up）自下而上的模式，即首先将蛋白酶解成肽段，然后利用液相色谱串联质谱技术分析肽段混合物，最后通过数据库检索实现蛋白质的鉴定。基于质谱的的外泌体蛋白质组学可以按照是否有同位素标记分为非标记定量蛋白质组学和稳定的同位素标记的蛋白质组学。
1.非标记定量蛋白质组学技术
非标记定量的蛋白质组学技术研究外泌体可以分为4个步骤：1）分离纯化外泌体 2）外泌体的裂解、蛋白提取和溶液酶解3）肽段的预分离和色谱质谱技术分析4）数据分析、蛋白鉴定定量和数据统计。非标记定量的蛋白质组学技术是一种基于肽段图谱计数的方法，以肽段被质谱检测到的次数肽段二级图谱匹配的数目作为定量的依据，在质谱的依赖数据采集的模式下，丰度更高的肽段被质谱选择进行碎裂的频率也就越高，基于图谱技术的非标定量蛋白质组学技术是研究外泌体最广泛的技术，当然还可以比较不同样品中蛋白酶解的肽段的色谱峰面积或者质谱离子信号强度进行相对定量，这种方法也常用于外泌体蛋白质组学的研究。
2.稳定同位素标记定量蛋白质组学技术
在EVs的研究中，最常用的稳定的同位素标记技术就是SILAC、iTRAQ、TMT, SILAC技术主要用于培养细胞的外泌体蛋白质组学的分析，比如利用SILAC技术标记非小细胞肺癌两种不同的细胞系以及正常人支气管上皮细胞，从三种细胞培养上清分离出外泌体进一步发现肺癌细胞外泌体中差异表达的蛋白在细胞侵袭、血管生成和增殖的作用。iTRAQ、TMT技术通用性更强，比如常用于体液来源的外泌体的分析，比较不同年龄人的尿液外泌体蛋白质的差异等等，随着TMT增加16标（TMTpro 16plex）同位素标签，通过与肽段特异氨基酸位点相连实现不同来源的肽段标记，然后进行串联质谱分析，监测碎裂下来的标签实现肽段定量。一次实验可灵活比较最多16种不同样本中蛋白质的相对含量，更加高效助力外泌体蛋白质组学的检测。
基于质谱的定量蛋白质组学技术分析外泌体的流程
随着对不同物种、不同组织和不同细胞来源的外泌体组成研究获得了大量蛋白质、RNA、脂类和其他分子数据，为了更加方便对外泌体的研究和更好的整合外泌体研究的数据，其中ExoCarta、EVpedia和Vesiclepedia这三个数据库是目前收录比较全面和具有影响力的数据库。
1. ExoCarta 数据库
ExoCarta数据库（http://www.exocarta.org/）是由Mathivanan等在2009年建立，是个收集EVs蛋白质和脂质的数据库，该数据库在2012年和2015年进行了升级，ExoCarta数据库主要收集外泌体的数据。
ExoCarta数据库主要包括人、大鼠、小鼠、果蝇、羊、牛、豚鼠、马、兔近10个物种的外泌体蛋白质、RNA和脂质分子的数据。外泌体来源近60种正常细胞或肿瘤细胞，如脂肪细胞、B细胞、T细胞、树突细胞等等，ExoCarta数据库目前收录了近9769种蛋白质、3408种mRNA、2838种miRNA和1116种脂质。
ExoCarta数据库可以查询多种生物来源的外泌体蛋白，查询得到的内容包括详细的外泌体来源的组织和细胞类型、外泌体分离纯化方法以及鉴定蛋白的方法。ExoCarta数据库还可以提供蛋白鉴定的质谱数据、蛋白质的免疫印迹、蛋白质的相互作用信息。ExoCarta数据库还能提供外泌体最常鉴定到的100种蛋白质，如CD9、HSPA8、PDCD6IP、GAPDH、ACTB、ANX2、CD63、SDCBP等等，需要注意的是这100种蛋白仅仅意味着它们经常在外泌体的研究被鉴定到，并不意味着它们在外泌体中富集，ExoCarta数据库同时也接受研究者上传自己的研究数据。
2.EVpedia数据库
EVpedia数据库（http://student4.postech.ac.kr/evpedia2_xe/xe/）是Kim等在2012年建立的，包含原核生物和真核生物的EVs高通量数据库，EVpedia数据库不仅包括EVs的蛋白质、mRNA、质脂和代谢物相关的数据，还包括微泡、纳米微泡和凋亡小体的EVs信息。
EVpedia数据库具有4大模块
1） 实验的得到的EVs蛋白质、mRNA、质脂和代谢物相关的数据，目前数据库共收录503个高通量产生的1114个数据集，包含了722551个条目
2） 该数据库支持根据物种、囊泡类型、分子和样品类型进行浏览和检索
3） 收录出版物的数据库，至少收录了14192篇和EVs相关的文献出版物
4） 生物信息工具分析，包括序列的搜索、集合分析、基因GO分析和网络分析等
EVpedia数据库还可以提供了EVs组成成分列表，可以查到人、小鼠和所有物种鉴定到EVs的前100个（按照鉴定次数降序排序），以及人、小鼠和所有物种鉴定到的前100个miRNA和mRNA分子，现在EVpedia已经成为了研究真核和原核的EVs重要的数据库。
3. Vesiclepedia数据库
Vesiclepedia数据库（http://www.microvesicles.org/）是由Mathivanan实验室在
2012年建立的，目的是为弥补ExoCarta数据库只包括外泌体数据的不足
Vesiclepedia数据库包含的囊泡类型比较全面，包括外泌体、微泡、凋亡小体、前体、大密度核心囊泡等等11种类型，目前数据库收录349988条蛋白条目、27646种mRNA、10520种miRNA和639种脂质这些来源于1254项研究和41个物种，包括人、大鼠、小鼠、马、羊、牛、狗、猪等等。
Vesiclepedia数据库是目前包含信息最丰富的EVs数据库，为EVs的研究提供了极为丰富的信息，通过数据库可以检索到蛋白、RNA、脂质分子，检索得到的注释信息较为丰富，包含EVs的类型、EVs的来源的组织和细胞类型、EVs的分离纯化的方法，该分子鉴定的方法以及文献信息等等。
总结：ExoCarta、EVpedia和Vesiclepedia3个数据库是目前最大的免费使用的EVs数据库，是研究外泌体的重要工具，尽管这些数据库为外泌体的研究提供信息，但是EVs的命名和专业术语本身没有统一的规定，不同的实验方法和技术对EVs的数据重复性提供了制约。无论怎样，数据库提供的信息还是非常丰富的，对于开展外泌体的研究了解物种的外泌体的信息有一定的指导作用和帮助作用。
五、外泌体的蛋白质组学的临床应用外泌体蛋白质组学研究在疾病发生发展、诊断治疗以及预后方面都有着巨大的前景。与传统循环标志物如细胞因子、激素相比，外泌体可在体液中稳定存在且半衰期长， 加之脂质双分子层的保护作用，外泌体能运送蛋白质等生物信息物质至靶器官; 与细针穿刺和组织病理检查相比，体液标本取材方便，创伤小，患者更易接受，便于多次取材，可应用于临床实时动态个体化诊疗中,我们整理了一些外泌体蛋白质在临床中的应用，基本包括诊断、检测、预后和病情变化方面。
外泌体蛋白质在临床中的应用部分总结
外泌体在正常和病理条件下均由细胞释放，它们携带多种类型的分子，如核酸和蛋白质，一直是用于临床诊断的生物标志物的关键。
例如:携带肿瘤特异性RNA的外泌体被用作癌症诊断的生物标志物，外泌体蛋白也为是多种疾病的潜在生物标志物，如TSG101, CHMP2A，RAS相关蛋白RAB11B ,CD63和CD81蛋白和脂类，包括胆固醇，鞘磷脂，神经酰胺和磷脂酰丝氨酸在癌症、肝病和肾病常用来作为疾病的标志物。
外泌体的大分子成分在细胞功能和病理状态中发挥着重要作用，如炎症、免疫反应、血管生成、细胞死亡、神经退行性疾病和癌症。比如四磷酸腺苷，膜支架蛋白家族，CD63和CD81也是潜在的癌症生物标志物。
此外，CD81水平升高与炎症和纤维化的严重程度相关，表明CD81可能是丙肝诊断和治疗反应的潜在生物标志物。
从胶质母细胞瘤患者血清中分离出来的外泌体显示出胶质母细胞瘤特异性表皮生长因子受体(EGFR) vIII的水平升高，这表明它可以作为癌症的诊断标志物。
外泌体包含Thr-181磷酸化的TAU淀粉样肽，是阿尔茨海默病的潜在生物标志物。同样，富含α-突触核蛋白和自溶酶体蛋白、组织蛋白酶D和溶酶体相关膜蛋白的外泌体在帕金森病中发挥着核心作用，这些外泌体也是潜在的生物标志物。
急性肾损伤患者尿外泌体中胎素A和与EGFR通路相关的蛋白水平增加，包括Gs蛋白、抵抗素和维甲酸诱导蛋白3,这些是肾脏疾病和膀胱癌的潜在生物标志物。
富含蛋白多糖glypican-1 (GP1)的血清外泌体被用作胰腺癌的生物标志物。
外泌体的生物学功能
综上：我们总结了EVs的发现、并根据其大小、生物特性和合成过程不同将EVs分为外泌体（exosome）、微囊泡（Microvesicles MV）和凋亡小体（Apoptotic bodies）三大类。针对外泌体的研究，对外泌体的分离纯化方法进行简单总结，基于质谱的蛋白质组学方法是外泌体蛋白质组学应用最广泛的技术，老师关注外泌体的研究，ExoCarta、EVpedia和Vesiclepedia3个数据库是是研究外泌体的重要工具，文章的最后我们对外泌体蛋白质组在疾病的诊断、检测、预后和病情变化进行总结，最后列举了一些疾病针对与外泌体的研究的biomarker，希望对研究外泌体的老师有所帮助。文章如有侵权部分，请联系作者删除
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